2021年發(fā)表于《食品工業(yè)科技》的文獻《米糠發(fā)酵產(chǎn)物抑制α葡萄糖苷酶的工藝優(yōu)化》，用枯草芽孢桿菌 MK15 對米糠進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物對 α－葡萄糖苷酶的活性具有較強的抑制作用，并對發(fā)酵條件進行了工藝優(yōu)化。在光譜分析環(huán)節(jié)，研究采用了歐世盛的在線傅里葉中紅外檢測器（FT-IR）對抑制產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)米糠發(fā)酵產(chǎn)物為含側(cè)鏈的多糖類物質(zhì)。

在線傅里葉中紅外檢測器

在線傅里葉中紅外檢測器是一款快速、準確且應(yīng)用廣泛的檢測儀器。紅外光和化合物相互作用后，引起化合物不同分子鍵發(fā)生相應(yīng)的振動及轉(zhuǎn)動，根據(jù)紅外吸收光譜的峰位、峰形和峰強，可以獲取不同化合物的特征吸收光譜圖，從而對未知化合物進行定性及定量分析。搭載一體化的ATR流通采集系統(tǒng)，可實時檢測被測樣品成分，適用于過程在線檢測。

01 特點1：

ZnSe；Diamond；Silicon ATR光學(xué)材料，適應(yīng)不同工業(yè)現(xiàn)場使用

02 特點2:

金反射鏡光學(xué)系統(tǒng)，抗氧化性強，光學(xué)性能更穩(wěn)定

03 特點3:

可搭載高靈敏度室溫檢測器或電制冷MCT檢測器，適用于微量化合物檢測

研究亮點及意義

該研究在菌種與底物方面進行了創(chuàng)新。選用食品源枯草芽孢桿菌 MK15（菌種篩選于四川泡菜，安全無害），以農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物米糠為底物，實現(xiàn)廢物利用，同時降低生產(chǎn)成本。通過 SEM 與 FT-IR 聯(lián)合表征，明確米糠發(fā)酵產(chǎn)物抑制α- 葡萄糖苷酶活性的化學(xué)本質(zhì)（含側(cè)鏈多糖）及微觀結(jié)構(gòu)（多孔塊狀），為其作用機制研究奠定基礎(chǔ)，也為同類農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化研究提供了方法學(xué)參考。

豐富了α- 葡萄糖苷酶抑制劑的來源渠道，證實微生物發(fā)酵農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物是獲取天然抑制劑的有效途徑，突破了傳統(tǒng)化學(xué)合成或天然提取的局限，有望為糖尿病防治提供新型天然功能成分。

導(dǎo)圖

實驗方法

本研究圍繞米糠發(fā)酵產(chǎn)物α-葡萄糖苷酶抑制劑展開，采用 “單因素實驗+響應(yīng)面優(yōu)化" 的核心思路，結(jié)合結(jié)構(gòu)表征技術(shù)，形成系統(tǒng)的實驗方案。

>>>> 菌種與材料選擇

選用從四川泡菜中篩選的枯草芽孢桿菌 MK15 作為發(fā)酵菌株，以米糠為發(fā)酵底物，搭配α- 葡萄糖苷酶、對硝基苯 α-D 葡萄糖吡喃苷等試劑，借助酶標儀、掃描電鏡（SEM）、傅里葉中紅外檢測器（FT-IR）等儀器完成實驗。

>>>> 關(guān)鍵實驗步驟

發(fā)酵種子制備：將枯草芽孢桿菌 MK15 接種至 NA 培養(yǎng)基，37℃、180r/min 培養(yǎng) 24h 活化菌種。

發(fā)酵與純化：按 3% 接種量將種子液接入米糠發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)發(fā)酵、離心、調(diào) pH 除蛋白、醇沉、Savage 法脫蛋白、冷凍干燥等步驟獲得純化產(chǎn)物。

抑制率測定：改良體外測定模型，通過 96 孔板反應(yīng)（37 ℃ 反應(yīng) 30 min），終止反應(yīng)并混勻后在 405nm 處測吸光值，采用 100、50、10、5、1、0.1、0.02 mmol /L 阿卡波糖作為陽性對照。吸光值代入公式計算α－葡萄糖苷酶活性的抑制率。

條件優(yōu)化：先通過單因素實驗考察培養(yǎng)時間、溫度、培養(yǎng)基初始 pH、米糠添加量、裝液量、轉(zhuǎn)速等因素對對 α－葡萄糖苷酶活性的影響；再選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始 pH 三個因素作為自變量，采用 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計組合試驗，建立回歸模型優(yōu)化工藝。

結(jié)構(gòu)表征及紅外光譜分析：利用 SEM 觀察產(chǎn)物（凍干粉）微觀形態(tài)。通過歐世盛傅里葉中紅外檢測器（FT-IR）分析官能團及糖鍵結(jié)構(gòu)，掃描范圍為4000～400 cm?1。

>>>> 數(shù)據(jù)處理

采用 Design Expert 10.0.6 軟件設(shè)計響應(yīng)面、數(shù)據(jù)分析及建立回歸模型，用 Origin Pro 2018 作圖，確保數(shù)據(jù)可靠。

實驗結(jié)果

>>>> 單因素實驗

通過實驗確定各影響因素條件為：培養(yǎng)時間 48h、溫度 35℃、培養(yǎng)基初始 pH8.0、米糠添加量 5%、裝液量 50mL/250mL、搖床轉(zhuǎn)速 180r/min。實驗發(fā)現(xiàn)糠在發(fā)酵中起到重要作用，當培養(yǎng)基中不添加米糠時，對α－葡萄糖苷酶活性沒有抑制作用。

>>>> 響應(yīng)面優(yōu)化

建立多元三次回歸模型（P<0.0001，失擬項P = 0.9709 ＞ 0.05 不顯著），擬合度好，誤差較小，R2 = 0.998 ＞ 90% ，關(guān)聯(lián)性較好，表示該模型可以反映響應(yīng)值變化，可用于分析及預(yù)測米糠發(fā)酵工業(yè)工藝。

三因素影響大小排序：培養(yǎng)時間 > 培養(yǎng)基初始 pH > 培養(yǎng)溫度，且培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間的交互作用較為顯著。

驗證實驗：選取溫度 35 ℃，時間 50 h，pH8.0 進行驗證，重復(fù)實驗三次并取平均值，所得 α－葡萄糖苷酶抑制率是 88.8% ，基本與模型預(yù)測值保持同一水平，上述結(jié)果表明響應(yīng)面法對米糠發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化有效。

>>>> 結(jié)構(gòu)表征

SEM 觀察顯示，米糠發(fā)酵產(chǎn)物脫水后形成片狀多孔塊狀結(jié)構(gòu)。FT-IR光譜分析表明，產(chǎn)物具有3424cm?1（O-H 伸縮振動）、1076cm?1（呋喃糖環(huán) C-O 伸縮振動）等特征峰，872 cm?1是α－1，3、α－1，4和 α－1，6糖苷鍵的特征吸收蜂，756 cm?1是α－1，6糖苷鍵的吸收峰，結(jié)果表明米糠發(fā)酵產(chǎn)物含有不同糖苷支鏈的多糖。

研究結(jié)論

本研究用枯草芽孢桿菌 MK15發(fā)酵米糠，其產(chǎn)物對 α－葡萄糖苷酶活性有較強抑制作用。采用響應(yīng)面法對米糠產(chǎn) α－葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

條件為: 培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時間50 h、培養(yǎng)基初始pH為8.0。經(jīng)實驗驗證，發(fā)酵產(chǎn)物對 α－葡萄糖苷酶抑制率為88.8% ，與理論預(yù)測值接近，比優(yōu)化前提高了 25.1% 。

通過SEM對米糠發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了表征，米糠發(fā)酵產(chǎn)物脫水后可形成多孔塊狀結(jié)構(gòu)；FT－IR的結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)物為含有側(cè)鏈的多糖類物質(zhì)。

研究結(jié)果為提高米糠的綜合利用和經(jīng)濟價值提供了科學(xué)依據(jù)。

主要圖表

圖1 培養(yǎng)時間（A）、溫度（B）、pH（C）對α－葡萄糖苷酶抑制率的影響

圖2 米糠添加量（A）、裝液量（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）對α－葡萄糖苷酶抑制率的影響

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果

圖 3 培養(yǎng) pH 與溫度的交互作用對 α－葡萄糖苷酶抑制率的影響

圖4 培養(yǎng)時間與溫度的交互作用對α－葡萄糖苷酶抑制率的影響

圖7 米糠發(fā)酵產(chǎn)物的紅外光譜圖（500～4000 cm-1）

參考文獻

賴曉樺，鄧甜，胡經(jīng)飛，陳德寧，呂明生，王淑軍．米糠發(fā)酵產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶的工藝優(yōu)化［J］．食品工業(yè)科技，2021，42(04) : 128－134．